摘要：該研究通過磁場強(qiáng)化彌補(bǔ)生物反應(yīng)器低溫運(yùn)行的不足, 考察磁場作用下活性污泥微生物在快速降溫、復(fù)溫沖擊條件下磷脂脂肪酸 (PLFA) 的變化規(guī)律, 結(jié)合PLFA生物標(biāo)記反映微生物的適冷性及磁場對活性污泥菌群抗冷沖擊性能的強(qiáng)化效果。結(jié)果表明, 快速降溫導(dǎo)致COD去除率下降40%, 磁場強(qiáng)化可提高COD去除率5%¹0%, 且有利于低溫下革蘭氏陰性菌的富集, 同時(shí)提高了微生物細(xì)胞膜內(nèi)PLFA的多樣性及微生物適冷性, 進(jìn)而提高了污水處理效率。

  溫度對微生物的新陳代謝起著決定作用, 溫度降低會導(dǎo)致微生物最大比生長速率和基質(zhì)利用率下降, 同時(shí)導(dǎo)致廢水的物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化, 影響生物反應(yīng)器的性能。在研究中發(fā)現(xiàn), 過快的冷卻速率會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)冰, 造成細(xì)胞的損傷。低溫 (0~10℃) 已成為目前生物水處理領(lǐng)域面臨的一大難題。

  低溫生化法處理污水工藝中通常通過考察磷脂脂肪酸 (PLFA) 的特性來反應(yīng)微生物的適冷性。PLFA為甲基化活性污泥中提取的磷脂后得到的脂肪酸產(chǎn)物, 總在專屬的一類微生物中出現(xiàn), 且一般只存在于活體細(xì)胞中。

  根據(jù)以上特性, PLFA鑒定技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物研究領(lǐng)域的微生物群落結(jié)構(gòu)表征。在細(xì)胞膜中, 脂類組成是保持膜流動以及相結(jié)構(gòu)的前提, 確保膜中的蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生理功能, 如電子轉(zhuǎn)移、營養(yǎng)吸收等。當(dāng)溫度降低時(shí), 膜流動性會隨之減弱, 從而影響膜的相結(jié)構(gòu)和正常功能。因此, 微生物必須通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)脂類的組成, 改變膜的流動性和相結(jié)構(gòu), 以適應(yīng)環(huán)境溫度的下降, 膜脂質(zhì)的改變主要是改變脂肪酸的組成。生物膜由磷脂雙分子層構(gòu)成, 雙分子層結(jié)構(gòu)具有不對稱性, 存在磁各向異性, 磁場導(dǎo)致其發(fā)生取向重排作用, 增加膜的通透性, 提高微生物的活性, 從而大大提高了低溫廢水的生物降解效率。污水處理工藝中針對不同類別的工業(yè)及生活污水加入磁場輔助降解有機(jī)物, 已經(jīng)成為一項(xiàng)新興的水處理技術(shù)。

  本研究通過磁場強(qiáng)化彌補(bǔ)生物反應(yīng)器低溫運(yùn)行的不足, 主要考察磁場作用下活性污泥微生物在快速降溫、復(fù)溫沖擊條件下的磷脂脂肪酸 (PLFA) 變化規(guī)律及污染物去除效率, 結(jié)合PLFA生物標(biāo)記反映微生物的適冷性及磁場對活性污泥菌群抗冷沖擊能力的強(qiáng)化效果, 為改善低溫污水生物處理效果提供依據(jù)。

1.研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)活性污泥反應(yīng)器在快速降溫及復(fù)溫條件下運(yùn)行, 研究低溫下活性污泥微生物抗冷沖擊 (Cold-shock) 性能及污水處理效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下: (1) 將反應(yīng)器置于生化培養(yǎng)箱內(nèi), 通過溫度控制器調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度。25℃下培養(yǎng)2個(gè)模擬序批式活性污泥反應(yīng)器 (SBR) A1、A2, 反應(yīng)器為3L的有機(jī)玻璃柱, 高度和半徑分別為30cm、5cm;A2在中心場強(qiáng)為30m T的磁場下運(yùn)行 (磁場以平行放置的2塊異極磁鐵產(chǎn)生, 通過調(diào)節(jié)磁鐵間距控制中心場強(qiáng)) , A1為A2的對照組, 無磁場設(shè)置。

(2) 反應(yīng)器在經(jīng)過常溫培養(yǎng)后, A1、A2經(jīng)歷快速降溫及復(fù)溫過程 (瞬時(shí)轉(zhuǎn)移至0℃及瞬時(shí)轉(zhuǎn)移至25℃) 。

(3) 反應(yīng)歷經(jīng)S1~S7 7個(gè)階段, S1為反應(yīng)器常溫下馴化穩(wěn)定后25℃運(yùn)行, S2-S4為快速降溫后低溫下運(yùn)行, S5~S7為快速復(fù)溫后25℃運(yùn)行, 每個(gè)階段運(yùn)行5d。

(4) 模擬廢水組成:C₆H₁₂O₆、NH₄Cl、KH₂PO₄, 以自來水配水濃度為400mg/L, 其中C:N:P為100:5:1 (質(zhì)量比) 。

(5) 設(shè)置反應(yīng)器循環(huán)周期為12h, 每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)放置1 L模擬廢水和1 L活性污泥, 曝氣量為4.0L/min, 水力停留時(shí)間 (HRT) 為10h, 固體停留時(shí)間 (SRT) 為10d。

(6) 反應(yīng)為序批式運(yùn)行, 進(jìn)水時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、沉降時(shí)間分別為0.2h、10h、1h, 過程中溶氧量為8.20~8.65mg/L。

(7) 污泥取自南京某污水處理廠, 裝入反應(yīng)器前污泥MLSS為4200mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 COD測定

COD測定方法采用快速密閉催化消解法。

1.2.2 PLFA提取與命名

PLFA通過提取與分離、皂化、甲基化、萃取、洗滌等處理, 采用安捷倫7890A氣相色譜測定。氣相色譜各參數(shù)由MIDI Sherlock程序設(shè)置調(diào)用。PLFA常用的命名格式為X:YωZ (c/t) , 其中, X是總碳數(shù);Y為雙鍵數(shù);ω表示甲基末端;Z是距離甲基端的距離;C表示順式, t表示反式;a和i分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu);10Me表示一個(gè)甲基團(tuán)在距分子末端第10個(gè)碳原子上;環(huán)丙烷脂肪酸用cy表示。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

磷脂脂肪酸數(shù)據(jù)通過SPSS18.0軟件進(jìn)行分析。在主成分分析 (PCA) 中, 個(gè)別PLFA含量以占PLFA總樣本中百分比的形式表示。經(jīng)過SPSS軟件降維得到2個(gè)主成分, 它們包含超過80%的差異度。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)通常被定義為:

 

式中, H為Shannon-Wiener指數(shù), s是每個(gè)樣品中磷脂脂肪酸的總數(shù), p_i為各磷脂脂肪酸占總峰面積的百分比。氣相色譜分析的峰面積用來計(jì)算每個(gè)磷脂脂肪酸的p_i值。

2.結(jié)果與分析

2.1 COD降解率

圖1描述了反應(yīng)器整個(gè)運(yùn)行過程中的COD去除率變化情況。A₁和A₂在S1常溫運(yùn)行階段保持76.8%~77.2%的平均COD去除率, 在S2階段2個(gè)反應(yīng)器瞬時(shí)轉(zhuǎn)移至0℃, COD去除率受到大幅度影響, 在S2~S4階段A₁和A₂的平均去除率分別為32.7%和37.6%;在S5階段2個(gè)反應(yīng)器瞬時(shí)轉(zhuǎn)移至室溫, 反應(yīng)器COD處理效率有一定的提高, 在S5~S7階段A₁和A₂的平均去除率分別為70.2%和73.7%。快速降溫對2個(gè)反應(yīng)器微生物有較大的沖擊, 導(dǎo)致COD去除率大幅下降;S2~S4階段A₂的去除率高于A₁可以發(fā)現(xiàn), 磁場對反應(yīng)器低溫下COD去除率有正向的強(qiáng)化作用, 對低溫下微生物適冷性有一定的促進(jìn)作用。同理在復(fù)溫后, A₂反應(yīng)器的去除率說明磁場強(qiáng)化更有利于活性污泥微生物低溫?fù)p傷的恢復(fù)及提高微生物降解有機(jī)物的效能。

 

圖1 反應(yīng)器不同階段COD去除率

2.2 PLFA生物標(biāo)記及脂肪酸分類分析

反應(yīng)器各階段運(yùn)行末期整個(gè)PLFA的碳鏈長度主要分布在C10~C20。微生物種群結(jié)構(gòu)即不同類群微生物的相對豐度, 可以通過微生物各種群的特征脂肪酸的相對含量表征。PLFA生物標(biāo)記可反映生物量、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的相對含量。生物量與十六烷脂肪酸 (16:0) 有著正相關(guān)關(guān)系, 可用該脂肪酸含量來表征總生物量相對大小, 多種支鏈脂肪酸可表征革蘭氏陽性菌, 單不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸則可指示革蘭氏陰性菌, 特定的磷脂脂肪酸 (如18:1ω9、18:2ω6、18:3ω6、18:3ω3) 可用于表征真菌。

圖2表示溫度變化的不同階段2個(gè)反應(yīng)器活性污泥菌群的種群結(jié)構(gòu)PLFA生物標(biāo)記。通過對常溫下、降溫末期及復(fù)溫末期各反應(yīng)器PLFA的測定, 常溫下A₁的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌所占比例與A₂對應(yīng)微生物比例都比較接近。降溫后歷經(jīng)S2~S4階段, 2個(gè)反應(yīng)器的革蘭氏陽性菌及真菌含量均有所降低, A₂的革蘭氏陰性菌比例明顯高于A₁。復(fù)溫后, 兩個(gè)反應(yīng)器生物量均有所下降, A₁、A₂的真菌含量恢復(fù)至降溫前的水平。

冷激實(shí)驗(yàn)主要考察在短時(shí)間內(nèi)微生物受冷沖擊所發(fā)生的相應(yīng)生理功能的變化。在降溫S4階段, 2個(gè)反應(yīng)器革蘭氏陽性菌出現(xiàn)下降趨勢, 與其短時(shí)間內(nèi)受低溫抑制有關(guān);有研究表明低溫下革蘭氏陰性菌有更好的適冷性, A₂的革蘭氏陰性菌含量高于A₁說明低溫下磁場強(qiáng)化有利于革蘭氏陰性菌的富集;復(fù)溫后2個(gè)反應(yīng)器較低的生物量說明快速降溫及復(fù)溫的擾動導(dǎo)致反應(yīng)器微生物受到一定程度損傷;真菌受溫度變化擾動相對較小, 但降溫及復(fù)溫沖擊下A₂真菌量高于A₁, 說明磁場強(qiáng)化有利于真菌富集, 提高了反應(yīng)器內(nèi)的生物多樣性。

 

圖2 溫度變化過程中PLFA生物標(biāo)記及活性污泥菌群變化

2.3 不飽和脂肪酸含量分析

圖3描述了2個(gè)反應(yīng)器中的不飽和脂肪酸含量的變化, 從圖3可以看出, C16:1ω7c、C18:1ω7c、C18:1ω9c 3種不飽和脂肪酸在每個(gè)反應(yīng)器微生物細(xì)胞膜中占主要成分 (平均含量>5%) 。在降溫末期A₁和A₂的不飽和脂肪酸含量明顯低于常溫運(yùn)行階段, 同時(shí)A₂的不飽和脂肪酸含量略高于A₁;在復(fù)溫階段2個(gè)反應(yīng)器的不飽和脂肪酸含量有所回升, 但仍低于降溫前的水平。

微生物細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量反映了微生物的適冷能力, 研究表明Bacillus subtilis中的脂肪酸去飽和酶對微生物抗冷沖擊具有積極的作用, 同時(shí)有研究表明不飽和脂肪酸對微生物適應(yīng)低溫環(huán)境具有促進(jìn)作用?？焖俳禍貙?dǎo)致2個(gè)反應(yīng)器微生物活性受到抑制, 且微生物難以在短時(shí)間內(nèi)調(diào)整膜內(nèi)不飽和脂肪酸含量以適應(yīng)環(huán)境;A₂反應(yīng)器含量在降溫和復(fù)溫階段均接近A₁說明磁場對快速降溫下微生物不飽和脂肪酸的強(qiáng)化作用較弱, 同時(shí)體現(xiàn)快速降溫對微生物通過不飽和脂肪調(diào)節(jié)機(jī)體適冷性的機(jī)能沖擊較大。

 

圖3 反應(yīng)器不同階段微生物細(xì)胞膜不飽和脂肪酸情況

2.4 主成分分析

主成分分析 (PCA) 可以通過2個(gè)反應(yīng)器PLFA的狀況反映微生物種群的變化。主成分1 (PC1) 和主成分2 (PC2) 分別含有52%和35%的差異度。從圖4可以看出, 因子C14:0 iso、C15:0 anteiso、C16:0 iso和C17:0 cyclo在PC1上有較高的負(fù)荷, 因子C16:1ω7c、C18:1ω7c、C18:1ω9c在主成分2上有較高的負(fù)荷。在快速降溫末期與常溫階段相比, A₁在PC1上有較大差異度, A₂在PC2上有較大差異度;在S4階段, A₁和A₂在PC1和PC2上均有差異度。

溫度是影響微生物生長導(dǎo)致磷脂脂肪酸組成差異的主要因素之一, 同時(shí)A₁和A₂之間的差異反映在PC1和PC2。PC1上高負(fù)荷的因子多為支鏈脂肪酸, 此為革蘭氏陽性菌的生物標(biāo)記因子;單烯不飽和脂肪酸在PC2上有較高負(fù)荷, 此為革蘭氏陰性菌的生物標(biāo)記。溫度作為主要環(huán)境因子直接導(dǎo)致革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在微生物群落上的多樣性差異, 同時(shí)在受到快速降溫冷沖擊后, A₁與A₂的差異度表明磁場強(qiáng)化同樣導(dǎo)致2個(gè)反應(yīng)器微生物菌群的多樣性差異。

 

圖4 反應(yīng)器不同階段磷脂脂肪酸主成分分析

2.5 Shannon-Wiener生物多樣性分析

微生物種群的多樣性體現(xiàn)種群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度, 相對穩(wěn)定的種群結(jié)構(gòu)對于生物反應(yīng)器內(nèi)微生物降解有機(jī)物具有積極的促進(jìn)作用。為了考察PLFA的豐富度和均勻度, 運(yùn)用ShannonWiener多樣性指數(shù)反映微生物種群多樣性。溫度變化的不同階段2個(gè)反應(yīng)器活性污泥PLFA的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)如圖5所示。從圖5可以看出, 在降溫末期A₁、A₂2個(gè)反應(yīng)器PLFA多樣性相比于常溫階段均有降低, A₁降幅最大 (5.74%) , A₂的PLFA多樣性在低溫運(yùn)行末期下降相對較小 (3.25%) 。在復(fù)溫后A₁、A₂的PLFA多樣性恢復(fù)甚至超過降溫前的水平, 且A₁的多樣性指數(shù)相對更高。

降溫會抑制中溫微生物生長活性, 使之休眠甚至死亡, 低溫微生物逐漸成為優(yōu)勢菌群, 但是由于低溫微生物生長速率相對較慢, 世代時(shí)間較長, 在數(shù)量上很難達(dá)到中溫微生物的水平, 造成低溫污水中微生物總量減少, 總體活性降低, 同時(shí)低溫下物種數(shù)量會隨之減少, 導(dǎo)致PLFA多樣性相應(yīng)減小?？焖俳禍貨_擊下A₂更高的多樣性指數(shù)表明磁場強(qiáng)化有利于提高微生物細(xì)胞膜內(nèi)PLFA的多樣性。復(fù)溫后中溫微生物開始大量繁殖, 活性污泥微生物總量和種群數(shù)量逐漸恢復(fù), 含有特定PLFA的物種數(shù)量也隨之增加, 使2個(gè)反應(yīng)器PLFA多樣性提高, 進(jìn)而提高低溫下污水處理效率。

 

圖5 不同階段磷脂脂肪酸Shannon-Wiener多樣性指數(shù) 

3.結(jié)論

(1) 快速降溫導(dǎo)致反應(yīng)器COD去除率大幅下降, 低溫運(yùn)行階段A₁和A₂的平均去除率分別為32.7%和37.6%, 磁場強(qiáng)化提高了A₂的COD去除率。

(2) 快速降溫下磁場強(qiáng)化有利于革蘭氏陰性菌的富集, 同時(shí)提高了微生物細(xì)胞膜內(nèi)PLFA的多樣性, 但對微生物通過調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸含量增強(qiáng)適冷性的強(qiáng)化作用較弱;主成分分析表明溫度和磁場導(dǎo)致快速降溫冷沖擊下2個(gè)反應(yīng)器革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在微生物群落上的多樣性差異。

(3) 通過磁場強(qiáng)化, 可以彌補(bǔ)快速降溫對活性污泥微生物的沖擊影響, 同時(shí)調(diào)節(jié)微生物活性及多樣性以提高污水處理效率。

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